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中風1號對急性期腦出血大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

時間:2019-11-05來源:本站作者:梁群,王叢,朱永志

[摘要] 目的 通過應用活血化痕中藥制劑中風 1 號治療急性期腦出血大鼠,觀察腦組織中 Bcl-2Bax蛋白表達的變化,探討其作用機制。 方法 以大鼠自體尾靜脈取血制作腦出血大鼠模型,造模3 d后斷頭取腦,應用免疫組織化學法檢測腦組織中 Bcl-2、Bax 免疫反應陽性細胞計數。 結果 造模后經治療3 d,與模型組相比,中風1號組及甘露醇組 Bcl-2陽性細胞數明顯升高(P < 0.05),Bax陽性細胞數明顯降低(P < 0.05),中風1號組與甘露醇組 Bcl-2/Bax比值遠大于1。 結論 活血化痕制劑中風1號通過調控抗凋亡基因 Bcl-2、Bax的表達,對急性期腦出血起到治療作用。

 

[關鍵詞]  急性期腦出血  中風1號  活血化痕  Bcl-2 Bax

 

腦出血屬于中醫出血性中風范疇[1]。 如何降低腦 血管疾病的死亡率和致殘率一直是醫學界要攻克的重 點。 隨著醫學界的專家們對急性腦血管疾病的不斷探 索, 應用中醫中藥治療急性腦出血逐漸受到國內外專 家的重視,臨床研究也顯示療效顯著[2-4]。 中風 1號為本文通信作者朱永志教授總結四十余年治療急性期腦 出血經驗形成的方劑,主要功效為活血化痕。腦出血多 為痕阻腦竅,痕血在急性期不除反而阻礙腦組織血運循環使致殘率增加。前期動物實驗發現中風1號可以 減輕腦水腫、保護神經組織[5],為中醫內科保守治療急 性腦出血奠定了基礎。本次實驗研究將在前期研究的 基礎上進一步明確中風1號治療急性期腦出血的作用機制。

 

1    材料與方法

1.1 實驗動物  SPF級別SD雄性大鼠40只,許可證號SCXK()2016-0006, 體質量180~220 g,由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心代為購買。普通專用飼料喂養于溫度(22±4) ℃,相對濕度 40%~70%,自然光線的實驗室,經過1周的適應性飼養后進行實驗。本

實驗嚴格遵守動物福利與倫理原則, 在黑龍江中醫 藥大學實驗動物管理和使用委員會監督下進行,倫理號2017092001。

 

1.2 試藥及儀器  1)試劑:兔抗大鼠 Bcl-2、Bax多克隆抗體購自Abcam公司;即用型快速免疫組化 Max VisionTM 試劑盒及DAB顯色試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。2)藥物:中風1號(組成:水蛙10 g,生大黃 10 g,澤瀉 15 g,三七粉 10 g,生地黃 15 g。由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制劑室熬制),按動物體表面積比率換算大鼠灌胃量,常規水煎至 3.5 g/mL(每毫升含生藥 3.5 g)。阿莫西林納舒巴坦納(哈藥集團生產,17070703-2),甘露醇(石家莊四藥有限公司生產,1709130503)。 3)儀器:大小鼠腦定位儀(上海玉研科學儀器有限公司生產)、 腦立體定位進樣針(上海玉研科學儀器有限公司生產)、動物顱骨鉆(上海玉研科學儀器有限公司生產)、 切片機 (德國萊卡生產)、超凈工作臺(蘇凈安泰生產)、光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司生產)。

 

1.3  分組及造模  SD大鼠40只隨機分為4組,每組10只,分別為假手術組、模型組、中風 1 號組、甘露醇 組。 除假手術組外,其余大鼠參照文獻[6]的方法制備模型。用 10%水合氯醒按大鼠體質量計算麻醉藥用量 進行腹腔注射麻醉。大鼠俯臥位固定于立體定位儀上,充分暴露囪門消毒備皮后切開大鼠頭頂部正中線皮膚約1 cm,暴露骨膜及前囪點,在前囪點右側3.5 mm,后0.2 mm處用牙科鉆鉆出直徑約1.0 mm的圓孔,深達硬 腦膜表面。同時鼠尾用酒精消毒,距尾末端3 cm處剪斷用微量注射器抽取50 μL血液,把微量注射器固定在 立體定位儀上,針頭沿鉆孔進針約6 mm,以20 μL/min速度將50 μL血液緩慢推進腦組織,留針觀察約5 min后緩慢出針。在留針期間包扎大鼠尾部傷口。取適量牙科水泥用純凈水調成糊狀封閉顱骨創口,待牙科水泥略干后縫合頭皮并用腆盼局部消毒,可在傷口表面撒 適量抗生素以防止感染影響指標變化。假手術組:動物 接受與模型組相同的操作但腦組織不注血。

 

1.4 給藥方法  在造模后2 h大鼠完全蘇醒后開始計時,中風1號組每日2 mL中藥湯劑(劑量約為成人用量的1倍)灌胃,假手術組、模型組每日等量生理鹽水灌胃,甘露醇組給予大鼠尾靜脈注射甘露醇0.5 g/(kg?d),共給藥3 d。

 

1.5 標本采集與檢  給藥3 d后,大鼠吸人麻醉后頸椎離斷處死,開顱取腦,以針道為中心,前后各移動2 mm切取4 mm厚腦組織。將切片浸于二甲苯中脫蠟0.5~1 h,乙醇脫水(步驟為100%乙醇5 min、100%乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min),蒸館水沖洗。在室溫下切片,用 3%甲醇雙氧水封閉 20~30 min,自來水沖洗;采用高壓修復之后放人PBS中。 然后用免疫組化筆將組織圍住,切片上滴加山羊血清封閉液, 保持在室溫20~30 min。 甩去多余液體,不洗,再在切片上滴加目的一抗,4 ℃過夜,次日取出來后待切片恢 復至室溫后,放人PBS洗3次,每次5 min。 切片上滴加二抗,37 ℃避光20 min后,放人PBS中洗3次,每次5 min,然后滴加DAB染液顯色5~10 s,水洗終止顯色。最后采用蘇木素復染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,封片完成。選擇各組的陽性和陰性組織相進行顯微照相; 選擇各組有意義的組織相進行讀取分析,最后存盤。顯微鏡下Bcl-2和Bax陽性反應物在胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽性細胞,計數陽性細胞。



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文獻出自:

中國中醫急癥 2019年1月第28卷第1期  JETCM. Jan. 2019,Vol.28,No.1

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